RT-qPCR引物/探針（套裝）

SARS-CoV-2 Confirm

一、產(chǎn)品用途：
RT-PCR引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測(cè)和分析病毒RNA。它僅用于研究，不用于臨床診斷。

二、產(chǎn)品描述：
1. 該產(chǎn)品包括三個(gè)小管：
①橙蓋：（凍干粉），1管。
此管為病毒引物/探針，可特異性擴(kuò)增的RdRp基因（即RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會(huì)被檢測(cè)到【1】【2】。（該引物/探針依據(jù)WHO診斷參考實(shí)驗(yàn)室公布的引物/探針序列而設(shè)計(jì)【1】。
如要檢測(cè)其他冠狀病毒，推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，貨號(hào)：271-1100。
②綠蓋： Positive Control RNA（陽(yáng)性對(duì)照RNA，凍干粉），1管。
此陽(yáng)性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。
③白蓋： PCR Grade Water（液體），1管。
2.使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級(jí)水（③白蓋）復(fù)溶，并分裝，避免反復(fù)凍融。
3.該引物/探針應(yīng)與MB公司提供的【RNA病毒檢測(cè)試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,
貨號(hào)192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于RT-qPCR反應(yīng)檢測(cè)。
4．檢測(cè)樣本需為抽提過(guò)的RNA樣本。
5.靶基因RdRp是用FAM™通道檢測(cè)，擴(kuò)增的人RNA酶P基因（過(guò)程對(duì)照）用ROX™通道檢測(cè)，用以評(píng)估樣本的制備質(zhì)量。

三、產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 靶點(diǎn)特別。依據(jù)WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，此引物探針為RdRp基因，而非市面上常見(jiàn)的ORF1ab和N基因或E基因。
2.陽(yáng)性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。
3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便，性能穩(wěn)定。
4. 適用于科研中，各種來(lái)源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌等。

四、需用戶(hù)自己準(zhǔn)備的試劑耗材和儀器：
1.RNA病毒檢測(cè)試劑盒（RT-qPCR法）
（英文名：ConviFlex™ RT-Taq Mix，貨號(hào)192-0025/-0100/-0250）
2.熒光定量PCR儀（qPCR儀）
3.無(wú)DNase和RNase的qPCR反應(yīng)管
4.離心機(jī)
5.移液器及帶濾芯吸頭（不含DNase和RNase）
6.用戶(hù)自己提取的RNA或現(xiàn)成的RNA樣品。（抽提過(guò)程建議使用商品化的RNA提取試劑盒完成，如MB廠家的：
【病毒RNA提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Kit，貨號(hào)611-1010/-1050/-1250）
或【病毒RNA拭子提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit，貨號(hào)611-2250）。

五、操作注意事項(xiàng)：
該引物/探針應(yīng)僅由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員使用。
始終穿上合適的防護(hù)服和戴一次性手套。
根據(jù)樣品類(lèi)型，應(yīng)謹(jǐn)慎處理所有樣品。請(qǐng)遵循WHO推薦的方法處理樣本。
該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。

六、操作步驟：
步驟1. 試劑制備
①橙蓋 Mix引物探針凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入525lPCR級(jí)水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。
②綠蓋Positive Control RNA陽(yáng)性對(duì)照凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入105lPCR級(jí)水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。


步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl反應(yīng)體積）
（1）1個(gè)反應(yīng)需要加入：酶預(yù)混液 （自備的紅蓋預(yù)混液）10l ，
橙蓋（復(fù)溶的Mix引物/探針）5l
（紅蓋預(yù)混液 來(lái)自MB公司的【RNA病毒檢測(cè)試劑盒】（RT-qPCR法），
英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號(hào)192-0025/-0100/-0250，需單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)）


（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。

（3）每個(gè)PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本（抽提后的RNA），
或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對(duì)照，或5μl PCR級(jí)水作為無(wú)模板對(duì)照，或5μl陽(yáng)性對(duì)照RNA。

（4）緊扣PCR管，然后短暫離心。

（5）將PCR管放置qPCR儀上，緊上頂蓋。


步驟3. 設(shè)置qPCR程序
1個(gè)循環(huán)： 55 ℃，10分鐘
1個(gè)循環(huán)： 94 ℃，3 分鐘
45個(gè)循環(huán)：94 ℃，15秒
58℃，30秒  

步驟4. 啟動(dòng)程序

步驟5. 數(shù)據(jù)解讀

七、使用注意事項(xiàng)：
1.使用前應(yīng)認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。
2.來(lái)自不同批次的試劑不能混合。
3.試劑盒內(nèi)的試劑應(yīng)始終作為一個(gè)整體溶解分裝。
4.試劑盒應(yīng)在效期內(nèi)使用。
5.每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照和/或一個(gè)無(wú)模板對(duì)照。如果實(shí)驗(yàn)者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對(duì)照。對(duì)照必須與待測(cè)樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實(shí)驗(yàn)室提供的對(duì)照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對(duì)照，對(duì)于確認(rèn)結(jié)果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
6.建議在無(wú)RNA和DNA污染的條件下進(jìn)行RT-PCR，以避免操作過(guò)程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號(hào)15-2025，預(yù)先清潔實(shí)驗(yàn)環(huán)境。）
7.盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù)，同時(shí)避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。（RNA降解會(huì)極大地限制了RT-qPCR反應(yīng)的性能）。請(qǐng)確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測(cè)。
8.樣本制備過(guò)程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會(huì)降低qPCR的準(zhǔn)確性。


八、參考文獻(xiàn)
1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of  by real-time RT-PCR.


2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.


九、精確檢測(cè)，還會(huì)用到：